什么是SURESELECT^{XT HS} ？

SureSelectXT HS 試劑盒作為安捷倫靈敏度高的雜交捕獲型文庫制備和 用于 NGS 的靶向序列捕獲解決方案，成為了 SureSelect 文庫制備試劑 家族中的成員。

----------------------------------------------主要特征---------------------------------------

• DNA 起始量 10 ng

• 針對高質(zhì)量完整 DNA 以及低質(zhì)量和高質(zhì)量 FFPE DNA 進(jìn)行了優(yōu)化

• 分子條形碼 (MBC) 標(biāo)記文庫可提高陽性預(yù)測值 (PPV)

• 復(fù)雜度更高的文庫，在靶標(biāo)區(qū)域中的讀出序列百分比更高

• 90 分鐘雜交和反應(yīng)預(yù)混試劑，實(shí)現(xiàn)更快速更高效的工作流程

FFPE 優(yōu)化文庫制備的重要性

盡管 FFPE 樣品為多種遺傳信息提供了有價(jià)值的來源，但從 FFPE 組織中分離 DNA 的難題 在于純化足夠分子量的 DNA 以及達(dá)到一定的擴(kuò)增和檢測質(zhì)量。通常而言，當(dāng) FFPE DNA 制備出來用于文庫生成時(shí)，其降解程度已過高而無法用于高靈敏度的 NGS。因此，有 必要通過優(yōu)化文庫制備與盡量減少步驟數(shù)降低樣品損失，并從挑戰(zhàn)性樣品類型中獲得 高質(zhì)量文庫。

針對 FFPE 優(yōu)化的安捷倫文庫制備

對于新鮮樣品與 FFPE 樣品中的多種組織類型，SureSelectXT HS 僅用 10-200 ng 起始原料即 可生成靶標(biāo)區(qū)域讀出序列百分比較高的更復(fù)雜文庫。為改善不同質(zhì)量 FFPE 樣品單核苷 酸變異 (SNV) 的識別和一致性，安捷倫已開發(fā)出一款完整的工作流程解決方案，該方 案具有 DNA 質(zhì)量預(yù)評估（FFPE QC 試劑盒，部件號 G9700A 和 G9700B 以及 4200 TapeStation 系統(tǒng)）和單管文庫制備功能。

 圖 1. SureSelectXT HS 已針對 FFPE 進(jìn)行了性能優(yōu)化，在質(zhì)量逐漸降低的樣品中多數(shù)堿基覆蓋率達(dá)到了 20X。 將測序深度越來越高的 20X 以上讀取深度覆蓋（4 百萬到 8 百萬 - 2×100 bp 讀出序列）的堿基百分比相對于 gDNA 質(zhì)量（基于 qPCR 的 gDNA 質(zhì)量 (ddCq)，并用安捷倫 FFPE QC 檢測試劑盒進(jìn)行計(jì)算）作圖

圖 2. SureSelectXT HS 在 100X 覆蓋率下優(yōu)于其他文庫制備解決方案，尤其是在樣品質(zhì)量下降時(shí)：根據(jù) 8 百萬 - 2×100 bp 讀出序列的 1000X 測序深度，將 100X 以上讀取深度覆蓋的堿基百分比相對于質(zhì)量越來越低的 gDNA （基于 qPCR 的 gDNA 質(zhì)量 (ddCq)，并用安捷倫 FFPE QC 檢測試劑盒進(jìn)行計(jì)算）作圖

高靈敏度的重要性

靈敏度指的是得到正確鑒定的真實(shí)變異的百分比。在大多數(shù)情況下，靈敏度受到起始 量、檢測性能以及 PCR 與測序錯誤率的限制。因此，傳統(tǒng) NGS 檢測的錯誤水平通常會 由于腫瘤異質(zhì)性而影響低頻變異的檢測可信度。

SureSelectXT HS 的出色靈敏度

SureSelectXT HS 中包括的分子條形碼可幫助用戶在文庫制備、靶向序列捕獲和測序等可能 產(chǎn)生假陽性變異的過程中過濾出假陽性結(jié)果。SureSelectXT HS 中的分子條形碼對罕見變異的檢測頻率低至 ≤ 1%。多數(shù)用戶采用置信閾值且僅對等 位基因頻率高于 3%-5% 的變異進(jìn)行識別，因此這一性能十分重要。

圖 3. 等位基因頻率低至 1% 時(shí)的檢測結(jié)果。SureSelectXT HS 生成的文庫在測序深度 3000X 時(shí)，即使在 VAF 頻率低至 1% 時(shí)觀測值和頻率預(yù)計(jì)值之間也具有高度關(guān)聯(lián)性（HD200 定量多重參考標(biāo)樣和 ClearSeq 綜合癌癥基因組合）

什么是分子條形碼？

分子條形碼是*的 DNA 序列，它附著在給定樣品中的每個(gè)原始 DNA 上。這些獨(dú) 特的 DNA 序列包含隨機(jī)的核苷酸、部分簡并核苷酸或核苷酸。分子條形碼附著在 DNA 上，為每個(gè)起始分子分配*的識別碼。

分子條形碼為何如此重要？

PCR 擴(kuò)增和測序過程中引入的錯誤提高了原始 DNA 模板的整體錯誤率。這些錯誤或假 陽性結(jié)果降低了樣品中低水平真實(shí)突變的靈敏度。這個(gè)問題尤其容易發(fā)生在某些腫瘤 亞群等異質(zhì)性更高的細(xì)胞群中。分子條形碼通過消除假陽性結(jié)果并提供誤差校正以實(shí) 現(xiàn)更準(zhǔn)確的變異識別，幫助用戶檢測模板 DNA 分子中的低頻突變。

圖 4. 利用分子條形碼 (MBC) 分析提高數(shù)據(jù)質(zhì)量。對 Horizon cfDNA 參照和定制 164 kb SureSelect 基因組合構(gòu)建的 SureSelectXT HS 文庫進(jìn)行靶向測序，在去冗余后達(dá)到了 808（標(biāo)準(zhǔn)）/906 (MBC) 的中等覆蓋率。經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)去冗余 后，在小于 2% 的變異等位基因頻率下檢測出 216 個(gè)非參照等位基因，而采用 MBC 得到的這一數(shù)字僅為 18。這表明錯誤識別減少了 92%。數(shù)據(jù)結(jié)果由英國倫敦癌癥研究所演化和癌癥中心的 L.J. Barber 博士和 M. Gerlinger 博士提供

 SureSelectXT HS 可減少單獨(dú)酶法步驟、清除步驟和樣品轉(zhuǎn)移，使用戶簡化工作流程并維 持文庫復(fù)雜度，在較低起始量（低至 10 ng）下更是如此。我們的 90 分鐘雜交與更高效的反應(yīng)預(yù)混試劑結(jié)合使用，可使用戶 在一天內(nèi)完成從樣品處理到生成待測序文庫的過程。此外，工作流程支持在一次混 合中對多 32 個(gè)樣品進(jìn)行深度多重測序。

優(yōu)點(diǎn)

• 90 分鐘雜交和反應(yīng)預(yù) 混試劑有助于更快速 更高效地處理樣品

• 在不到一天的時(shí)間內(nèi) 將樣品轉(zhuǎn)化為待測序 文庫

• Agilent SureCall 軟件有 助于簡化數(shù)據(jù)分析 簡化的工作流程有助于加快分析速度

 SureSelect 文庫制備與靶向序列捕獲解決方案

安捷倫公司具有多種文庫制備和靶向序列捕獲解決方案，適用于癌癥和遺傳性疾病應(yīng) 用。無論 DNA 起始量低至 10 ng 或高達(dá) 3 µg，文庫制備和靶向序列捕獲解決方案均可與 ClearSeq 基因組合、SureSelect 外顯子組或定制基因組合完美匹配。